同行评审研究警告：辉瑞与莫德纳疫苗残留DNA远超安全上限，SV40序列引发争议

同行评审研究警告：辉瑞与莫德纳疫苗残留DNA远超安全上限，SV40序列引发争议

一项研究显示，辉瑞和莫德纳疫苗中存在高水平的质粒DNA残留，且辉瑞疫苗中检测到的SV40启动子-增强子序列超出监管限值。该研究现已通过同行评审、正式发表，并即将在PubMed数据库上线。论文详细阐述了这些疫苗注射可能通过多种机制对人体健康造成显著且尚未量化的风险。

这是一篇极为重磅而专业的研究报告，为了确保其专业性和真实性，笔者将论文部分内容翻译如下，这无疑证实了笔者多年来一直强调的关系，Covid-19疫苗将对很多人身体造成不可逆转的伤害，当然，很多人已经没有机会看到这样的结论出现——因为已经离世。

摘要：部分新冠疫苗在上市后所使用的药物成分，其生产方式与临床试验阶段不同。用于商业化新冠疫苗的核苷酸修饰信使RNA（modRNA）是通过RNA聚合酶转录质粒DNA模板制成的。此前研究发现，modRNA疫苗瓶中存在高水平的质粒DNA残留，表明去除DNA模板存在技术难题。

因此，研究人员采用两种独立方法，对有限数量的辉瑞-BioNTech和莫德纳modRNA新冠疫苗瓶中的DNA残留量进行了定量分析。研究对象为32个疫苗瓶，涵盖16个不同批次。使用Qubit荧光法测定总DNA含量，使用定量PCR（qPCR）检测特定DNA靶点；同时通过RNase A处理评估RNA干扰对DNA测定的影响，并初步分析了DNA片段长度及其对DNase I的敏感性。

结果显示：

辉瑞疫苗每剂总DNA含量为371–1,548纳克，莫德纳为1,130–6,280纳克；
多个质粒DNA靶点的特定DNA含量：辉瑞为0.22–7.28纳克/剂，莫德纳为0.01–0.78纳克/剂；
SV40启动子-增强子-复制起始序列（SV40 promoter-enhancer-ori）仅在辉瑞疫苗中检测到，含量为0.25–23.72纳克/剂；
使用Oxford Nanopore测序技术分析其中一个样本，发现DNA片段平均长度为214碱基对，最长达3.5千碱基对；
每剂疫苗中包裹于脂质纳米颗粒（LNP）中的质粒DNA片段数量估算为1.23×10⁸至1.60×10¹¹个。

在荧光法检测中，所有样本的总DNA含量均超过美国食品药品监督管理局（FDA）和世界卫生组织（WHO）设定的残留DNA安全上限：辉瑞超出36–153倍，莫德纳超出112–627倍（已考虑modRNA的非特异性结合）。在qPCR检测中，所有莫德纳样本均在安全范围内，但辉瑞中有2个批次（共3瓶）SV40序列含量超出上限2倍。

研究指出，辉瑞疫苗中SV40启动子-增强子序列的存在引发重要安全隐患。该研究强调，在modRNA产品中进行残留质粒DNA定量分析时，必须考虑检测方法的差异、LNP转染效率的提升以及多次接种所带来的潜在健康风险。

研究背景与目的概述：由于化学合成大分子RNA（超过200个碱基）成本高且容易出错，科学家们通常使用T7 RNA聚合酶从DNA模板合成修饰RNA（modRNA）。这些DNA模板通常通过化学合成短片段后再酶促拼接、聚合，并克隆进质粒中完成。质粒DNA可通过直接裂解大肠杆菌或PCR扩增目标插入片段进行纯化，不同方法会导致疫苗中残留DNA的类型和数量差异显著。

疫苗制造工艺的变化：Moderna采用的是不经PCR的质粒DNA纯化方法，而Pfizer在获得FDA批准后也从临床试验阶段的PCR方法（工艺1）转向了类似Moderna的PCR-free质粒纯化方法（工艺2）。由于工艺2使用了更大的质粒模板（7.8Kb），相比工艺1的PCR扩增片段（4.2Kb），可能导致疫苗中残留DNA含量显著增加。

残留DNA检测的挑战：Pfizer用于检测残留DNA的qPCR方法仅针对质粒中的KAN基因，未能全面覆盖质粒和插入序列，可能低估了残留DNA的实际水平。此外，DNase I酶对RNA:DNA杂合体的降解能力有限，导致某些区域的DNA难以清除。

质粒结构差异与潜在风险：Pfizer（辉瑞）使用的质粒为pcDNA3.1衍生物，具备SV40病毒的复制起始点、增强子和启动子，可在哺乳动物细胞中复制。研究指出，这些SV40序列可能与癌基因激活或抑癌基因失活相关。McKernan等人在2023年通过RNA测序发现，Pfizer和Moderna疫苗中均存在高拷贝质粒DNA残留，且Pfizer疫苗中含有SV40启动子序列，但这些信息未在EMA监管文件中披露。

研究方法与目标：研究团队从加拿大安大略省收集了32瓶疫苗样本，使用qPCR和荧光定量方法检测了残留DNA的具体序列（如spike基因、质粒复制起始点、SV40启动子等）及总量，并分析了DNA片段的大小分布和是否被包装进脂质纳米颗粒（LNP）。最后，将这些数据与VAERS系统中报告的不良事件进行比对，以评估潜在关联。

材料与方法

新冠疫苗样本批次
略…..。这些未开封的疫苗瓶均保持完整，瓶盖未被破坏，批号和有效期清晰可见。

略…..。近期使用过的疫苗瓶（在注射后30分钟内）也被放入冷冻凝胶包中，并在12小时内送达实验室冰箱。

qPCR分析：Spike、ori及SV40启动子-增强子-复制起始序列（SV40 promoter-enhancer-ori）

疫苗不良事件报告系统（VAERS）数据分析

使用R语言统计计算环境分析VAERS数据库 [引用18]，数据范围为2020年12月17日至2023年10月6日。美国VAERS数据可下载为三个CSV文件，分别包含：

1）每份报告的基本信息；

2）报告的不良事件（AE）或“症状”；

3）疫苗信息，包括生产商与批号 [引用9]。

另有一份非美国（foreign）VAERS数据集，包含全球其他国家向监管机构提交的不良事件报告。每份报告分配一个VAERS ID编号以保护隐私。为分析特定疫苗相关的不良事件，需使用VAERS ID将三份数据文件合并。

本研究仅纳入COVID-19疫苗类型：COVID19-1（单价）与COVID19-2（双价）。其他分析变量包括：VAERS ID、疫苗批号（VAX_LOT）、生产商（VAX_MANU）、住院（HOSPITAL）、残疾（DISABLE）、急诊就诊（ER_ED_VISIT）、出生缺陷（BIRTH_DEFECT）、危及生命事件（L_THREAT）与死亡（DIED）。https://wxa.wxs.qq.com/tmpl/mw/base_tmpl.html

数据按疫苗批次（VAX_LOT）分组，统计每批次的不良事件（AE）与严重不良事件（SAE）报告总数。SAE包括死亡、住院、急诊、残疾、出生缺陷与危及生命事件。研究查询了美国与非美国数据，但主要结果仅报告加拿大批次。加拿大报告通过SPLTTYPE变量识别，其前两个字符为国家代码“CA”。研究还计算了VAERS数据与spike、ori及SV40 DNA水平之间的相关性，并使用皮尔逊相关系数进行统计分析。

核酸酶敏感性评估（Assessment of Nuclease Sensitivity）

略

讨论

在所调查的全部32瓶疫苗中均检测到残留DNA。来自同一批次的多个疫苗瓶在各个检测靶点上的DNA含量非常接近，显示出检测方法的可靠性、可重复性以及批次内的一致性。这些来自加拿大分发疫苗瓶的数据，与多项已发表和未发表的研究报告（如McKernan、Buckhaults、Konig、Raoult、Kämmerer、Wang）关于modRNA疫苗中DNA残留的发现一致。

在qPCR检测中，莫德纳疫苗的DNA浓度最低，但在Qubit荧光法中却是最高。莫德纳各瓶之间的DNA含量非常一致，表明其生产过程更为稳健和标准化。除批次AS0467D外，莫德纳疫苗瓶中的ori序列含量普遍低于刺突蛋白序列，暗示其在去除质粒DNA方面更为有效。可能是同源修饰RNA通过与模板DNA形成杂合结构，阻止了其被降解。

值得注意的是，AS0467D为双价BA.1疫苗，其由两种不同纯度的mRNA脂质纳米颗粒（LNP）混合而成。由于DNase I在RNA-DNA杂合物存在时活性受抑，不同的modRNA构建可能具有不同的二级结构或与DNA的杂合潜力，从而影响酶活性。这种spike与ori序列之间的极端差异反映出不应存在的制造偏差，强调监管机构不应仅依赖单一PCR检测来评估最终药品中的质粒DNA残留量。

DNA浓度最高的疫苗瓶来自辉瑞单价疫苗紫盖批次（PBS缓冲液配方），需稀释后使用。2021年10月29日，美国FDA批准将配方改为Tris/蔗糖缓冲液，用于灰盖成人疫苗和橙盖儿童疫苗（6–11岁）。此举旨在提升稳定性、简化储存要求，并提供即用型产品。

这些紫盖辉瑞批次也与VAERS系统中报告的最高不良事件（AE）和严重不良事件（SAE）数量相关。虽然原因尚不明确，但PBS缓冲液可能导致最终产品中出现可见颗粒，可能与微栓塞和炎症反应等毒性相关 [引用30]。此外，脂质水解和醛类生成导致的脂质杂质也被观察到，形成脂质加合物，可能具有毒理学影响。Tris缓冲液可作为“醛类吸收剂”，减少LNP杂质，这一机制已被莫德纳科学家证实。加合物可能导致modRNA功能丧失，影响mRNA的高级结构、动力学，甚至引发未知机制。

即使经历了三年的生产经验，疫苗批次间和批次内的DNA残留差异仍然存在。尤其是辉瑞疫苗，这种持续的差异性可能比单纯降低杂质水平更为根本，因为它反映出生产过程的不一致性，也可能影响其他工艺或产品相关杂质。不同供应商或批次的DNase酶纯度和稳定性可能存在差异。IVT（体外转录）过程中的微小差异也可能影响DNA残留水平。

辉瑞/BioNTech疫苗的DNase处理步骤曾在欧洲药品管理局（EMA）批准时被建议加强其稳健性 [引用34]。然而，德国通过信息公开法（FOIA）获得的文件显示，在授权15个月后，辉瑞/BioNTech的多个生产基地仍存在DNA残留水平不一致的问题，包括使用内部“标准”以及DNase酶活性与DNA残留之间缺乏关联性。这表明去除DNA片段的努力仍未取得理想成效。

我们对残留DNA含量与VAERS系统中SAE报告之间关系的探索性分析尚属初步，样本量有限，但值得通过更多批次和疫苗瓶进行验证。初步结果显示，尤其在ori序列方面，不良事件报告数量与DNA水平之间可能存在相关性。需要其他独立实验室进行更多检测，并开展前瞻性长期监测以确认结果。

在qPCR检测中，辉瑞批次FD0810（所检测的最早批次）显示spike和SV40序列含量较低，ori序列与其他紫盖成人疫苗相当，但却与VAERS中报告的最高AE总数相关。由于仅检测了一个瓶子，可能无法代表整个批次。若不清楚每批次的规模或接种人数，仅凭16个批次的数据难以建立SAE与批次之间的明确关联。如果某批次接种人数远高于其他批次，则可能扭曲SAE/人比率，进一步增加分析难度。

然而，我们的发现表明，除了质粒DNA水平外，LNP结构、毒性、自身免疫反应或核糖体移码引发的异常免疫反应也可能导致不良事件，包括补体激活相关伪过敏反应（CARPA）。疫苗瓶中DNA片段的随机组成使得DNA水平与特定不良反应之间的直接关联变得复杂，因为每个片段的基因毒性效应取决于其序列及与宿主基因组的相互作用，具有不可预测性。这种变异性使得仅凭DNA数量难以准确估算不良反应风险。

更高的DNA负载也可能带来长期健康风险，例如通过基因组整合事件诱发癌症。VAERS主要记录短期不良事件，可能低估了长期影响。需要进一步检测疫苗瓶，以建立基于VAERS数据的剂量-反应曲线。长期前瞻性监测对于评估基因疫苗的影响至关重要，尤其是在已检测到疫苗接种后最长达704天仍存在spike蛋白（刺突蛋白）的情况下。

Moderna与Pfizer疫苗批次之间的残留DNA差异： 研究发现，Moderna疫苗批次在qPCR检测和荧光法（fluorometry）估算残留DNA方面呈现不同的关系。这些差异可能源于两种疫苗在剂量体积、DNA数量、DNA片段大小分布、质粒载体序列组成以及脂质纳米颗粒（LNP）成分上的不同。此外，不同批次之间的杂质或污染物水平也可能影响结果。

潜在污染物与毒理机制：

碎片化mRNA：可能影响微RNA（miRNA）过程，具有潜在毒性。
双链RNA（dsRNA）：由T7 RNA聚合酶启动子引起，可诱导促炎细胞因子，可能与心肌炎等免疫炎症反应相关。
脂多糖（LPS）：可与刺突蛋白的S1和S2亚单位结合，增强炎症反应。

不良事件（AEs）与疫苗批次的关联： 更广泛的样本采集可能揭示更多不良事件类型（如死亡）与疫苗批次的关联。尽管目前研究的批次未包含在Schmeling等人的研究中，但仍需进一步探讨DNA污染与不良事件之间的潜在关系。

SV40增强子与基因整合风险： 虽然SV40增强子可促进核定位，但尚未证实COVID-19 modRNA疫苗中DNA片段的基因组整合。然而，DNA污染可能激活先天免疫反应，具有促血栓和促癌风险，尤其是GC含量高的片段。

qPCR与荧光法的局限性与偏差：

qPCR无法检测小于扩增片段（105–114 bp）的DNA，可能低估总残留量。
使用单一扩增子可能导致估算偏差高达100倍。
Moderna疫苗中刺突DNA的含量远高于非刺突DNA，暗示DNase I酶在RNA互补区域的降解效率受限。

荧光法的误差来源与改进建议：

高RNA浓度可能干扰DNA特异性染料，导致DNA含量高估。
冷冻-解冻循环、样本处理误差也会影响测量结果。
建议结合RNase A处理以去除modRNA，提高DNA定量准确性。

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测量方法对结果的影响： Pfizer疫苗使用荧光法和紫外光谱法测量RNA，qPCR测量DNA。这种选择性使用不同方法可能导致RNA/DNA比例估算差异显著。

测序与DNA片段偏差： Oxford Nanopore测序（ONT）偏向检测大于150 bp的片段，可能低估小片段DNA的存在。常规DNA纯化方法也容易丢失小于100 bp的片段。

监管标准与重新评估的必要性： FDA目前规定疫苗中残留DNA应低于10 ng/剂量，且DNA片段小于功能基因（约200 bp）。这些标准适用于“裸露”DNA，但由于modRNA疫苗中DNA被LNP包裹并高效转染细胞，现行标准可能需要重新评估。

FDA与WHO关于疫苗中残留DNA的指导原则：

FDA和WHO对疫苗中可接受DNA残留量的指导原则受到FDA科学家Sheng-Fowler等人研究的影响。该研究关注宿主细胞基因组DNA的污染，并指出当污染物是小型病毒载体时，每纳克DNA中分子数量显著增加。在这种高拷贝污染物的情况下，极微量（飞克级至阿克级）的DNA可能等同于纳克级宿主细胞DNA。由于modRNA疫苗中的DNA片段较短，每剂疫苗中的DNA分子数量可能超过1000亿个。这些残留DNA具有高拷贝数，富含启动子、SV40哺乳动物复制起始点、开放阅读框（ORFs）以及核定位序列。

脂质纳米颗粒（LNP）包装的影响：

FDA和WHO的指导原则未考虑DNA被包装在脂质纳米颗粒中，这可能导致DNA在体内存留时间更长，并提高转染效率。此外，这些指导原则也未考虑使用LNP平台进行modRNA疫苗的累积接种风险。研究表明，LNP可使RNA或DNA进入细胞的效率提高10至100倍。

日本的疫苗接种情况与累积风险：

在日本，有13%的人口接种了七剂COVID-19疫苗，且加强针间隔时间有时短至两个月。此外，针对其他感染的疫苗若采用相同的质粒和LNP平台，其累积接种风险在制定残留DNA指导原则时也未被考虑。

DNA片段长度与整合风险：FDA的指导原则仅对长度大于200碱基对的DNA片段进行定量，部分原因是认为短于此长度的片段无法形成功能性基因。然而，Klinman等人指出，短至7碱基对的DNA片段也可能存在整合风险。此外，指导原则可能假设短片段裸露DNA更容易被宿主核酸酶降解，但这种假设不适用于被LNP保护的疫苗DNA。

功能性DNA片段的潜在危害：Klinman等人还指出：“在评估质粒整合的潜在危害时，应注意将具有强调控区域的质粒引入宿主基因组的风险远高于随机点突变。”

SV40序列的功能性与潜在风险：现行指导原则未考虑残留DNA是否包含核定位序列、哺乳动物复制起始点和启动子等功能性元件，而这些在Pfizer疫苗中确实存在。Vacik等人证明，Pfizer载体中的SV40增强子是一种强效核定位序列，在基因治疗中具有潜力。Senigl等人指出，SV40增强子是具有致瘤潜力的体细胞高突变元件。Drayman等人则发现，Pfizer疫苗中的SV40增强子可与P53结合，提示我们应重新审视残留DNA的纳克级限值，尤其是考虑其功能性与复制能力。

结论: 本研究数据显示，在所检测的modRNA新冠疫苗中，每剂含有数十亿至数千亿个DNA分子。通过荧光法结合RNase A消化处理，所有样本的残留DNA含量均远超美国FDA与世界卫生组织（WHO）设定的每剂10纳克的安全上限，超标幅度达36至627倍。

qPCR检测结果显示，所有莫德纳疫苗瓶均在监管限值之内，而辉瑞疫苗中有3瓶样本的SV40启动子-增强子-复制起始序列（SV40 promoter-enhancer-ori）超出限值，并表现出显著的批次内与批次间差异。由于qPCR对不同基因靶点的检测结果差异较大，可能低估总DNA含量，因此强调应采用多种检测方法以准确评估DNA负载。

监管机构亟需制定清晰一致的标准，用于量化modRNA疫苗中的mRNA与质粒DNA。最新的XBB.1.5版本莫德纳与辉瑞疫苗的PCR结果表明，其DNA残留水平并未较早期版本有所降低。

我们的研究进一步加深了对疫苗安全性的担忧，并质疑现行监管标准是否仍适用于采用高效LNP转染技术的新型疫苗。尽管本研究存在若干局限，我们仍呼吁在法医学条件下重复验证本研究结果，并修订相关标准，以充分考虑高效DNA转染与累积接种的潜在影响。

本研究强调，监管机构与疫苗制造商应遵循“预防原则”，提供充分且透明的证据，证明产品的安全性与有效性，并公开其成分构成与生产工艺的详细信息。

（参考论文65篇，此处略）论文自www.tandfonline.com