伊维菌素和芬苯达唑，它们最初被发现并用作胃肠道抗寄生虫药物。它们杀死寄生虫，主要针对肠道内的寄生虫。它们基本上是动物驱虫药。伊维菌素用于许多动物，但最著名的是用于马，而芬苯达唑用于狗。但伊维菌素也已作为人类的抗寄生虫药使用了数十年。

因此，有大量相关数据。但近年来，部分得益于COVID大流行，研究显示它们也能杀死癌症，在实验室中、在小鼠中，甚至在人类中。而且所有这些都没有严重副作用。

1987年获批用于人类，[伊维菌素]在应对世界上一些最具危害的热带疾病方面发挥了关键作用，例如盘尾丝虫病、淋巴丝虫病（也称为象皮病）、类圆线虫病和疥疮。它还能有效对抗动物的寄生虫感染，这对畜牧业可能造成经济毁灭性打击……伊维菌素是已知最安全的药物之一。它位列世界卫生组织的基本药物清单，已在全球分发超过40亿次，并因其在全球范围内根除许多地区地方性寄生虫感染的历史性影响而获得诺贝尔奖。”

WHO疥疮指南：“大多数副作用都是轻微且暂时的”

Jacques Descotes教授，毒理学家及伊维菌素安全性专家：“严重不良事件无疑且极为罕见”
LiverTox数据库：不被认为对肝脏有毒性
Nephrotox数据库：不被认为对肾脏有毒性
PneumoTox：不被认为对肺部有毒性

伊维菌素作为人类抗寄生虫药的标准剂量为每天0.2mg/kg。对于一个190磅的男性来说，这是17.2毫克。但即使剂量高得多，高达10倍，它也极其安全：

关于伊维菌素的关键是要理解它的安全性，这意味着即使作为预防措施服用它也没有真正缺点。而且从迄今为止的脚注中可以看出，医学文献中有大量关于伊维菌素的信息。但更重要的是，在过去五年中，至少有九篇关于伊维菌素抗癌特性的研究论文发表在医学和药理学期刊上。

尽可能简要总结研究发现，伊维菌素至少有15种抗癌作用机制。有证据表明伊维菌素可以治疗几乎所有类型的癌症，最重要的是包括结肠癌，甚至4期结肠癌。伊维菌素已被证明能杀死癌细胞，既在体外（在培养皿中）也在体内（在活体生物中，主要为小鼠）

体外研究：
乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、头颈癌、黑色素瘤 – 抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、自噬、逆转他莫昔芬耐药性、抑制转移
胶质母细胞瘤 – 生长抑制、细胞凋亡和抗血管生成

体内研究（在免疫缺陷小鼠上进行）：
急性髓细胞白血病 – 肿瘤体积减少高达70%
胶质母细胞瘤 – 肿瘤体积减少高达50%
乳腺癌 – 肿瘤体积减少高达60%
胶质瘤 – 肿瘤体积减少高达50%（剂量0.24mg/kg），但在相当于人类0.8mg/kg的剂量下，肿瘤不可检测！
结肠癌 – 肿瘤体积减少高达85%
所用中位剂量相当于人类0.4 mg/kg，从10天至42天（口服、腹腔注射或瘤内注射）
伊维菌素的体外和体内抗肿瘤活性是在基于健康和寄生虫感染患者的人体药代动力学研究中临床可达到的浓度下实现的

关于芬苯达唑在人类中的使用研究不多，虽然没有关于其副作用的硬性数据……
……大多数人没有副作用。少数经历副作用的小群体主要抱怨是：
* 轻度腹泻
* 轻度胃部不适
* 肝酶升高

芬苯达唑抗肿瘤研究大汇总

Dr. Tang Dr. Tang 营卫荣养 2024年9月13日

芬苯达唑（Fenbendazole）用作犬类和其他动物的抗寄生虫治疗药物。芬苯达唑与寄生虫的β-微管蛋白结合，引起微管的不稳定，从而破坏寄生虫的细胞功能，如葡萄糖摄取，进而影响其能量代谢。由于口服吸收较差，芬苯达唑特别适用于靶向肠道寄生虫。

2016年8月，芬苯达唑因Joe Tippens的成功康复案例而引起了全球关注。Joe Tippens被诊断为小细胞肺癌。当时，他正参与一项新型抗癌药物的临床试验。同时，在一位兽医的指导下，Tippens开始自行口服222毫克芬苯达唑，并辅以维生素E补充剂、CBD（大麻二酚）油和姜黄素。三个月后，PET扫描显示他的体内没有可检测到的癌细胞。值得注意的是，在1100名临床试验参与者中，Tippens是唯一一位癌症完全治愈的患者。尽管Joe Tippens的案例具有吸引力，但它仅是一个轶事性报告，这突显了开展严格的临床试验来验证芬苯达唑作为抗癌疗法的有效性和安全性的必要性。

芬苯达唑的抗癌活性已在多种细胞系进行了体外研究，显示对多种癌细胞具有抑制效果。对5-FU、紫杉醇和多西他赛耐药的癌细胞也表现出抑制作用。尽管芬苯达唑显示出令人振奋的抗癌效果，但它的水溶性非常差，给药后血药浓度很低。因此，解决其药代动力学方面的限制对于将芬苯达唑用于癌症治疗至关重要。

芬苯达唑的抗癌机制与靶点

芬苯达唑的抗癌机制包括激活p53，抑制葡萄糖转运蛋白GLUT1和己糖激酶，减少癌细胞的葡萄糖摄取。

增强的糖酵解是肿瘤进展的一个关键信号。与正常细胞不同，癌细胞即使在有氧条件下也通过糖酵解将葡萄糖代谢为乳酸供能。尽管糖酵解不是一种高效的供能方式，产生的ATP比氧化磷酸化少，但癌细胞特别依赖这种糖代谢方式。糖酵解产生的乳酸使肿瘤微环境酸化，可导致药物耐受。

葡萄糖转运蛋白GLUT1在99%的鳞状细胞癌患者和50%的腺癌患者中高度表达，因此被认为是癌症治疗中的一个有前景的靶点。芬苯达唑通过激活p53抑制GLUT1和己糖激酶II（HKII）的表达，阻止癌细胞利用葡萄糖。因此，芬苯达唑可以导致癌细胞“饥饿”，破坏癌细胞能量代谢，从而降低乳酸水平，逆转药物耐受。

除了抑制糖酵解外，芬苯达唑还能诱导癌细胞凋亡。在结直肠癌（CRC）细胞中，芬苯达唑通过线粒体损伤和caspase 3-PARP通路触发凋亡。在野生型CRC中，芬苯达唑通过增加p53表达激活p53介导的凋亡。

微管在有丝分裂，细胞结构维持及其他细胞事件中有重要作用，是一种有前景的癌症治疗靶点。一些化疗药物通过抑制微管聚合（如长春新碱和长春花碱），而另一些则通过稳定微管（如紫杉醇和多西他赛），导致细胞凋亡和周期阻滞。芬苯达唑在多个人类癌细胞系中显示出抑制微管聚合活性，抑制癌细胞增殖并增强凋亡。

芬苯达唑的药代动力学

由于芬苯达唑尚未获得在人类中使用的监管批准，其人体药代动力学数据有限。美国食品药品监督管理局（FDA）最近授予芬苯达唑的主要代谢物氧芬达唑（oxfendazole）快速通道认证，用于治疗人体毛首鞭虫病。对氧芬达唑的药理学研究有助于补充对芬苯达唑在人类药代动力学的理解。

芬苯达唑在肝脏中部分吸收，中间代谢产物为氧芬达唑（芬苯达唑亚砜），羟基芬苯达唑，和芬苯达唑砜。尽管给药后芬苯达唑砜在血浆中占主导地位，但氧芬达唑是芬苯达唑主要的生物活性代谢产物。

雄性大鼠口服给药，芬苯达唑的血药浓度上限为0.32微克/毫升。在肝脏代谢后，芬苯达唑及其代谢产物通过粪便和尿液排泄。牛口服给药后，36%的芬苯达唑在粪便中被回收，而尿液中未发现任何残留物。在静脉给药时，超过50%的芬苯达唑剂量以羟基芬苯达唑的形式排泄。

安全性和毒性

在动物实验中，芬苯达唑显示出较高的安全性和较低的毒性。在一项针对牛的安全性研究中，即使以处方剂量的六倍和推荐使用时长的三倍使用芬苯达唑，动物依然能够良好耐受。在啮齿动物中，其半数致死剂量（LD50）超过10克/千克，这相当于治疗水平的1000倍。在大鼠的终生研究中，未发现母体或生殖毒性及致癌性。然而，观察到肝细胞肥大和增生的形态学改变。

芬苯达唑的主要代谢产物氧芬达唑在人类中具有良好的耐受性。在一项针对70名健康受试者的随机、双盲、安慰剂对照的I期临床研究中，评估了从0.5到60毫克/千克的氧芬达唑多种递增的口服剂量。该剂量研究发现，即使在连续5天每天给药高达15毫克/千克的情况下，其安全性和耐受性也在可接受范围内。

使用芬苯达唑的一个主要挑战是其低水溶性和生物利用度。提高水溶性是关键，因为这将减少达到相同治疗效果所需的药物剂量。上面Joe Tippens的例子里，Joe在口服芬苯达唑的同时还服用了CBD油，和油同服有助于芬苯达唑的分散溶解，对吸收可能有改善作用。

芬苯达唑作为人类癌症治疗方法尽管芬苯达唑作为癌症治疗药物在缺乏监管批准和广泛的临床试验，一些癌症患者已根据病例报道自行使用该药物。下面的表格里例举了一些病例报告，口服芬苯达唑单药或与化疗药联用都使肿瘤缩小，一例无效。有两个病例出现了药物相关的肝功能障碍，肝功能在停用芬苯达唑后恢复。

由于芬苯达唑价格较低且可在柜台购买，一些患者将其作为一种家庭癌症治疗方法。根据已发表的病例报道，最常见的自行使用方案是每天口服1克芬苯达唑，连续服用三天，然后停药四天。然而，芬苯达唑作为人类癌症治疗药物的使用需要进一步的临床试验，以确定有效的剂量和方案。肝功能受损、肝硬化或肝癌的患者应谨慎使用芬苯达唑。此外，将芬苯达唑与糖酵解抑制剂和保肝药物或营养补充剂联合使用，可产生协同的治疗效果，同时减少潜在的肝毒性。

芬苯达唑抗肿瘤谱、潜在分子机制及口服纳米药物研发

原创翟崇凯，付秀虹等翟崇凯，付秀虹等中国合理用药探索Chinahlyy 2025年5月9日

引用文本: 翟崇凯，杨少哲，张清伟，张贺伟，付秀虹^*.芬苯达唑抗肿瘤谱、潜在分子机制及口服纳米药物研发[J].中国合理用药探索，2025，22（4）：1-11.

目的：探索芬苯达唑（FBZ）的抗肿瘤谱，基于网络药理学与分子对接技术解析其治疗结肠癌的潜在作用机制，并开发具备良好口服性能的FBZ纳米制剂，助力FBZ的临床应用转化。方法：首先采用CCK-8法、克隆形成实验及流式细胞术，筛选FBZ对7种常见肿瘤类型（结肠癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌和胰腺癌）9种细胞系的抗肿瘤活性；通过网络药理学和分子对接方法，初步解析其作用于结肠癌的关键靶点与信号通路；制备基于胆酸盐载体的FBZ口服纳米药物，以克服其低水溶性限制。结果：FBZ对结肠癌细胞系的抑制效果最显著，随后依次为前列腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌及胰腺癌。网络药理学发现6个关键靶点，即BRAF、KDR、RAF1、MMP1、MAPK8和MAPK14；KEGG富集主要通过癌症通路、Rap1信号通路、VEGF信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路、MAPK信号通路、Relaxin信号通路和FoxO信号通路等。分子对接结果显示，FBZ与靶蛋白MAPK14、BRAF及其突变体BRAF V600E和RAF1具有良好的结合活性。FBZ口服纳米药物粒径大小约为300 nm，水溶性达到0.5 mg/ml，提高了约500倍。结论：FBZ 在体外对结肠癌细胞表现出极高的敏感性，可能通过多靶点、多通路协同作用抑制肿瘤进展。开发的口服纳米制剂显著改善其水溶性，为FBZ潜在的临床抗肿瘤用药提供参考，并为未来的转化研究奠定基础。

关键词: 芬苯达唑；抗肿瘤；网络药理学；结肠癌；水溶性；纳米药物

芬苯达唑（fenbendazole， FBZ）作为一种广谱苯并咪唑类驱虫药，长期用于治疗犬、猫等动物的寄生虫感染^[1]。近年来，FBZ因一则《癌症患者“使用狗药抗癌成功”》的报道而引起学者的广泛关注，使得FBZ被重新定位，加速其老药新用研究进程^[2]。随着研究的不断深入，越来越多的证据表明，FBZ除了驱虫活性外，还是一种潜在的抗肿瘤候选药物。Peng等^[3]发现FBZ通过积累活性氧（reactive oxygen species，ROS）来诱导氧化应激，抑制HeLa细胞的增殖。Wang等^[4]发现FBZ可剂量依赖性抑制人卵巢癌细胞A2780和SKOV3增殖。FBZ通过靶向破坏微管聚合、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、抗血管生成和阻断葡萄糖转运等抗肿瘤活性靶点，并扰乱内源性凋亡、经典Wnt/β-catenin、JAK/STAT-3、JNK、MEK/ERK和hedgehog等多种信号通路发挥抗肿瘤作用^[5-6]。进一步研究发现^[7-8]，FBZ对5-氟尿嘧啶耐药的肿瘤细胞SNU-C5高度敏感，表明FBZ具有作为一种化疗药物补充佐剂的潜能，与常规化疗药物联合使用有利于耐药肿瘤的治疗和降低肿瘤耐药性的产生。

尽管FBZ在体外试验、动物模型中对多种肿瘤类型展现出良好的抑制作用，但目前仍缺乏系统性的大样本临床研究与充分的机制验证，尚未被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于肿瘤治疗^[9]。现阶段，苯并咪唑类药物如甲苯达唑和阿苯达唑已被批准用于人类寄生虫感染的治疗，但FBZ通常不作为人类临床常规用药，仅在极少数情况下被纳入罕见人用寄生虫病治疗的研究范畴，且FBZ在人类中的药动学和安全性尚未在临床中进行详细研究，极大地阻碍了FBZ的临床应用^[10]。鉴于FBZ前期大量的动物实验证实FBZ对多种动物具有较高的安全性和耐受性，理论上会大大缩短FBZ老药新用和兽医药品向人类药品再开发的研发时间和成本^[11]。此外，由于FBZ缺乏一个明确、广泛且经过系统验证的癌症治疗谱，也在一定程度上限制了其在肿瘤领域的临床药物开发与转化应用。本研究拟通过采用CCK-8法、克隆形成实验及流式细胞术，筛选FBZ对7种常见肿瘤类型（结肠癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌和胰腺癌）细胞系的抗肿瘤活性，绘制FBZ的抗肿瘤谱，并通过比较3种检测方法的特点，建立一种快速且可靠的评估方法，用于检测肿瘤细胞系对FBZ的敏感性，为FBZ临床应用提供依据。

结肠癌作为一种高度异质性的恶性肿瘤，其发生发展过程中伴随多种遗传与表观遗传变化。其中，微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）和Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因（Kirsten Rat Sarcoma Viral Oncogene Homolog KRAS）突变是最常见且具有临床意义的分子事件。MSI是由于脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）错配修复系统缺陷所致的基因不稳定，约15%的结肠癌患者存在MSI，与肿瘤药物的敏感性密切相关^[12]。约有35%~45%的结肠癌患者存在KRAS基因突变，该突变主要集中在第12和13号密码子。KRAS突变导致抗表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）单抗在KRAS突变患者中疗效显著降低^[13]。此外，BRAF、PIK3CA、TP53、APC等基因的异常表达与结肠癌密切相关^[14]。Shimomura等^[15]证实FBZ可选择性抑制KRAS突变的肺癌细胞。为了探明FBZ抗结肠癌的分子机制，本研究采用网络药理学与分子对接技术解析其治疗结肠癌的潜在作用机制。

口服给药作为一种常用的给药途径，具有方便、经济、安全的优点，特别适用于需要长期用药的癌症患者。FBZ存在水溶性和生物利用率低的问题，严重阻碍了其口服药物的开发^[11]。胆酸盐作为动物机体肠道内的天然活性物质，毒性较低。前期研究证实^[16]，以胆酸盐为载体制成的氯硝柳胺纳米药物，不仅可以提高其水溶性，还可以利用胆酸盐转运系统快速吸收目标药物氯硝柳胺入血，提高药物的生物利用率。本研究采用基于前期开发的胆酸盐递送系统制备FBZ口服纳米药物，初步评估FBZ的纳米制剂特征，为FBZ的临床转化应用提供一定的研究参考。基于此，本研究旨在为探明FBZ的抗肿瘤谱、潜在分子机制以及开发FBZ口服纳米药物的临床研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 细胞和试剂

本研究为评估FBZ的抗肿瘤谱，选择了代表7种不同肿瘤类型的9种人肿瘤细胞，包括结肠癌（HCT116和HCT15）、肺癌（H460）、肝癌（HepG2）、胰腺癌（SNU-213）、乳腺癌（Hs58T和MDA-MB-231）、卵巢癌（SK-OV-3）、前列腺癌（PC-3），以及正常成纤维细胞（CCD-18C和IMR-90）细胞系，均保存于洛阳职业技术学院河南省地标药材与生命健康工程研究中心。CCK-8试剂盒购自Abcam公司，DMEM培养基购自Gibico公司，胆酸盐和FBZ购自Sigma公司。

1.2 CCK-8法

细胞以每孔1.0×10⁴个细胞在含有10%FBS和抗菌药物的DMEM培养基中接种于96孔板中，37℃孵育24 h。加入不同浓度的药物，并在37℃下孵育48 h。使用CCK-8试剂盒测量细胞活力，依据说明进行操作。生成8点剂量-反应曲线（dose-response curve，DRC），化合物浓度范围在适当浓度内。DRCs由Prism 7使用S型剂量-响应模型进行拟合，半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC₅₀）值均根据归一化活性数据集拟合曲线计算。

1.3 克隆形成实验

取融合度超过90%的肿瘤细胞进行消化计数后，转移细胞至6孔板中，每孔细胞数约10³个细胞，加入不同浓度的FBZ，置于37℃，5% CO₂培养箱中培养。培养1~2周后，当出现肉眼可见的集落时，取出细胞培养板，弃除培养液，每孔加入2 ml多聚甲醛固定30 min，弃除多聚甲醇，每孔加入2 ml 0.1%结晶紫染色3 min，然后清洗掉结晶紫，相机拍照并计算集落数。

1.4 流式细胞术

采用流式细胞术快速筛选FBZ对不同肿瘤细胞株的毒性效果。细胞重悬后在含有10% FBS的DMEM 培养基中37℃下培养24 h后，进行药物处理。24~48 h后收集细胞，参照LIVE/DEAD^TMFixable Dead Cell Stain Kits（赛默飞公司，Cat No.L34960）说明书染色后，在Attune Nxt流式细胞仪（赛默飞公司）中进行检测。该试剂盒的活性染料可以渗透死细胞的细胞膜，并在细胞内部和表面与游离胺反应，产生强烈的荧光。结果采用Flowjo软件进行分析，计算细胞的死亡率，确定药物的抗肿瘤效果。

1.5 网络药理学预测FBZ抗结肠癌的潜在靶点及分子机制

在Pubmed上以fenbendazole和colon cancer为关键词进行检索，初步筛选出fenbendazole相关的作用靶点。在Pubchem数据库中将fenbendazole成分保存为标准延迟格式（standard delay format，SDF）文件。通过瑞士靶点预测（swiss target prediction，STP）数据库和结构相似性靶点预测（similarity ensemble approach，SEA）数据库导入fenbendazole SDF文件查询潜在作用靶点及基因信息，最后将靶点基因合并，删除相同基因保留唯一项。在人类孟德尔遗传在线（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数据库和基因卡片（gene cards）数据库以colon cancer为关键词进行检索，合并相同项获得colon cancer相关的病毒靶点。使用维恩图绘制工具Venny 2.1.0找出化合物靶点和疾病靶点之间的重叠靶点。将化合物-疾病的重叠靶点添加到用于检索基因/蛋白质相互作用的搜索工具（search tool for the retrieval of interacting genes/proteins，STRING）中，筛选条件为“homo sapiens”，并保存结果。将结果文件导入到Cytoscape v3.7.1软件中，使用软件中的BisoGenet和CytoNCA插件计算度中心性（degree centrality，DC）、介数中心性（betweenness centrality，BC）和接近中心性（closeness centrality，CC）。蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的核心靶点被筛选出来。利用注释、可视化与综合发现数据库（Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery，DAVID）进行基因本体（geneon tology，GO）富集和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway Analysis，KEGG）通路分析。

1.6 分子对接模拟验证FBZ的关键靶点

使用Schrodinger Maestro软件评价关键靶蛋白和FBZ的结合能力。在对接之前，从蛋白质数据库（protein data bank，PDB）下载靶蛋白质的三维（3 dimensions，3D）结构，并使用软件内ligGprep模块构建化合物的3D 结构。受体蛋白质使用Protein Preparation Workflow模块，优化氨基酸和去除水分子和杂质。最后采用Ligand Docking模块进行分子对接分析。

1.7 FBZ纳米口服药物的制备及特性

将制备的10 mg/ml FBZ 二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液，按指定体积比（FBZ∶胆酸=1∶5）快速加入10 mg/ml胆酸钠溶液中。采用SCIENTZ-IID超声波破碎仪（新芝生物），将溶液混合物在100 W下超声60 s，产生纳米粒子。超声处理后，通过真空蒸发去除溶剂。最后，将纳米粒子重新悬浮在超纯水。采用Zetasizer Nano-ZS90纳米粒度仪（马尔文帕纳科公司）测定纳米粒径；采用Jasco UV/Vis V-770紫外分光光度计（佳司科公司）测定FBZ的溶解度（吸收峰为293 nm）。

2 结果

2.1 FBZ抗肿瘤效果

本研究采用3种不同检测方法评估了FBZ对不同肿瘤细胞系的抗肿瘤效果。CCK-8检测结果如表1和图1所示，FBZ对所有的肿瘤细胞系均显示出抑制效果，而对正常对照细胞系的毒性较小，IC₅₀超出检测范围。对结肠癌的抑制效果最佳，IC₅₀约为400 nmol/L，其次为前列腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌和胰腺癌。对照组为正常结肠成纤维细胞CCD-18C和正常肺成纤维细胞IMR-90，在2000 nmol/L浓度下未观察到明显的细胞毒性。克隆形成实验结果基因显示（图2A），500 nmol/L FBZ对所有肿瘤细胞系均显示良好的抑制效果（图2B）。与对照组相比，FBZ对结肠癌的抑制效果具有极显著的统计学差异（P<0.01），FBZ对结肠癌细胞系的抑制效果与肺癌、肝癌、前列腺癌细胞系具有显著的统计学差异（P<0.05），与其余肿瘤细胞系具有极显著的统计学差异（P<0.01）。流式细胞术检测了FBZ（500 nmol/L）的细胞死亡率（图3A），FBZ 对结肠癌细胞系的致死率最高，与肺癌细胞系具有显著的统计学差异（P<0.05），与其余肿瘤细胞系具有极显著的统计学差异（P<0.01）（图3B）。3种检测方法均显示，FBZ对结肠癌细胞系的敏感性最强，其余肿瘤细胞系对FBZ的敏感性结果基本一致。表明本研究开发的流式细胞术能够用于快速检测不同肿瘤系对FBZ的敏感性，为后期FBZ在临床中的应用奠定基础。

2.2 网络药理学分析

网络药理学分析结果显示，FBZ-结肠癌靶点取交集后（图4A）共得到6个靶点BRAF、KDR、RAF1、MMP1、MAPK8和MAPK14，进一步筛选发现MAPK14、BRAF和RAF1可能为FBZ高效靶向性治疗结肠癌的靶蛋白。在结肠癌发展进程中，MAPK14、BRAF和RAF1等靶点起着重要作用（图4B），可能是FBZ治疗结肠癌的潜在作用靶点。因此，靶向MAPK14、BRAF和RAF1可能为结肠癌治疗提供一种具有前景的新策略。GO富集分析可知（图4C），FBZ抗结肠癌的靶基因涉及丝裂原激活蛋白酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）活性调节、结合蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性调节、细胞凋亡调控、蛋白质磷酸化调控和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate， ATP）能量代谢等生物过程。KEGG结果显示（图4D），共富集36条信号通路，如癌症通路、Rap1信号通路、VEGF信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路、MAPK信号通路、Relaxin信号通路和FoxO信号通路等。

2.3 分子对接

采用Schrodinger Maestro软件进行分子对接，FBZ与靶点蛋白MAPK14、BRAF及其突变体BRAF V600E、RAF1的亲和值分别为-5.76、-7.01、-6.99 和-5.41。FBZ与靶点蛋白MAPK14、BRAF及其突变体BRAF V600E、RAF1等有良好的结合活性，表明FBZ可能通过抑制MAPK14、BRAF及其突变体BRAF V600E、RAF1活性来发挥抗结肠癌作用（图5）。

2.4 口服纳米药物的制备及特性

由于FBZ的水溶性较差，极大地限制了其抗肿瘤药物的应用。本研究开发的FBZ纳米颗粒，粒径大小为300 nm，水溶性从0.9 μg/ml提高至0.5 mg/ml，

提高了约500倍（图6）。

3 讨论

苯并咪唑类药物如阿苯达唑、甲苯达唑及FBZ，长期作为广谱抗寄生虫药物用于动物及人类寄生虫病的防治。FBZ最初作为兽医临床专用药物，在治疗线虫、钩虫等肠道寄生虫中显示出高效、安全和良好的耐受性^[1]。苯并咪唑类具有类似于天然嘌呤核苷酸的结构，很容易与代谢活动的多种效应分子发生结合^[8]。苯并咪唑类药物抗寄生虫的作用机制为阻断寄生虫和哺乳动物细胞的微管系统，抑制葡萄糖摄取和转运，最终导致细胞死亡^[17]。研究发现^[18]，苯并咪唑类药物具有抗肿瘤的新型药理活性，逐渐引起研究者们对其作为潜在抗癌药物的探索兴趣，且目前多种苯并咪唑类药物（如FBZ、甲苯达唑、阿苯达唑等）已被作为抗癌药物重新审视。老药新用作为一种有价值的开发替代策略，其候选药物在动物实验中的药动学、药效学和安全性特征完善，会大大加速药物研发和临床批准进程。目前已初步证实了苯并咪唑类在体外和动物模型中对肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、头颈癌和黑色素瘤有较强的抑制活性^[19]。甲苯达唑和阿苯达唑作为人类临床常用的广谱驱虫药，在高剂量抗肿瘤研究中甲苯达唑比阿苯达唑显示出更高的安全性，阿苯达唑具有较强毒性，并导致中性粒细胞减少^[20]。在髓母细胞瘤、胶质母细胞瘤和黑色素瘤的啮齿动物异种移植模型中，高剂量口服甲苯达唑可有效抑制肿瘤进展^[21]。部分临床病例研究也发现甲苯达唑能够有效缓解肾上腺皮质癌和结肠癌进程，并能够增强三阴性乳腺癌的放射治疗效果，表明甲苯达唑具有良好的抗肿瘤效果^[22-23]。然而临床研究发现，口服高剂量甲苯达唑（4 g/d），只有50%患者的血药浓度能够达到治疗的最低浓度要求（300 ng/ml），极大限制了临床应用^[24]。尽管FBZ在临床上也存在血药浓度不足的问题，但FBZ在苯并咪唑类中的抗肿瘤效果最佳，尤其是在耐药性肿瘤的治疗中显示出巨大的应用前景。Shimomura等^[15]研究发现，FBZ对KRAS突变肺癌细胞的抑制作用比其他苯并咪唑衍生物更强。Elmaaty等^[25]发现FBZ对血管内皮生长因子受体2型（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2）拮抗作用强于甲苯达唑，能够有效抑制肿瘤血管的形成。Jung等^[26]发现FBZ能够通过作用于程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）发挥抗肿瘤作用。此外，FBZ因其低成本、高安全性和独特多途径抗增殖活性，成为苯并咪唑类用于癌症治疗的首选^[9]。

FBZ作为一种兽医抗寄生虫药物的重新评估，加速了其老药新用的抗肿瘤研究进程。鉴于FBZ通常最初不作为人类临床用药，在临床抗肿瘤研究中缺乏一个广泛、安全的抗肿瘤谱。本研究通过CCK-8、克隆形成实验及流式细胞术筛选发现FBZ对结肠癌的抑制效果最好，其次为前列腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌和胰腺癌。开发的流式细胞术能够对不同肿瘤的细胞系进行快速筛选，结果与传统的CCK-8、克隆形成实验结果基本一致。此外，发现具有多重耐药性的结肠肿瘤细胞系HCT15的IC₅₀与HCT116的IC₅₀相似，而紫杉醇对HCT15的IC₅₀较HCT116的IC₅₀高约200倍，提示FBZ可能通过非TUBB3途径抑制微管形成，或通过其他机制发挥抗肿瘤作用^[27]。网络药理学分析显示，FBZ可能通过RAF1等靶点抑制微管的形成，提示FBZ在抗结肠癌以及肿瘤耐药性方面具有巨大的潜力。

结肠癌作为全球发病率与死亡率第3位的恶性肿瘤，治疗费用昂贵，给社会和医疗系统带来了沉重的负担^[14]。MSI和KRAS基因突变与结肠癌临床用药和预后具有高度相关性^[12-13]。本研究应用的结肠癌细胞系为HCT116和HCT15，两者的MSI检测结果均为MSI-High，HCT116是hMLH1基因纯合无意义突变，HCT15是MSH6突变，提示对常用化疗药物不敏感^[28]。鉴于MSI-High型结直肠癌临床治疗中面临的药物敏感性不足问题，本研究进一步探索了FBZ在该类结肠癌细胞系中的潜在抗肿瘤活性，通过网络药理学和分子对接探讨其作用机制，旨在为该类难治性肿瘤提供新的治疗思路。网络药理学分析发现，FBZ抗结肠癌的靶基因涉及MAPK激酶活性调节、结合蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性调节、细胞凋亡调控、蛋白质磷酸化调控和ATP能量代谢等生物过程。KEGG结果显示，共富集36条信号通路，如癌症通路、Rap1信号通路、VEGF信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路、MAPK信号通路、Relaxin信号通路和FoxO信号通路等。分子对接结果显示，FBZ的主要靶基因MAPK14、BRAF及突变体BRAF V600E和RAF1与FBZ具有良好的结合活性。Ariey-Bonnet等^[29]体外研究发现，甲苯达唑能够作为有效的MAPK14抑制剂。本研究也通过分子对接验证了FBZ作为一种有潜力的MAPK14抑制剂。BRAF是EGFR信号通路中重要信号分子，其突变可导致MAPK通路下游持续性激活，引起肿瘤细胞分化、增值、代谢及生长改变^[30]，是结肠癌重要的负向预后因子。BRAF V600E是结肠癌最重要的突变，突变率约为10%，突变后导致BRAF蛋白单体活化以及后续MEK1和MEK2蛋白活化，促进细胞增殖和抑制细胞凋亡^[31]。HCT15为非BRAF突变细胞，HCT116为BRAF突变细胞，提示HCT15和HCT116可能对化疗药物的敏感度差异较大^[32]。分子对接结果显示，FBZ能够靶向BRAF及突变体BRAF V600E，且其对突变型BRAF V600E 的对接分数略高于野生型BRAF，这解释了FBZ对HCT15的IC₅₀略高于HCT116。García-Alonso等^[33]研究发现，靶向RAF1蛋白可诱导大多数肿瘤消退，且无明显毒性。上述结果表明，FBZ具有作为MAPK14、BRAF及突变体BRAF V600E和RAF1抑制剂的巨大潜能。

尽管FBZ展现出良好的抗肿瘤潜力，但因其水溶性差（几乎不溶）和生物利用度低（约20%），极大限制了口服制剂的开发与临床转化^[11]，且个体吸收差异大，部分患者无法在临床口服剂量下达到抗癌的血药浓度^[9]。为了克服FBZ的上述问题，采用不同策略已研究开发出多种纳米药物，但其抗肿瘤效果参差不齐，且存在潜在的肝脏毒性风险^[34-35]。胆酸盐是机体肠道中天然存在的活性成分，作为药物佐剂的生物毒性较低。此外，胆酸盐具有分子两亲性，而肠道内存在高效的胆酸盐递送载体，为开发基于胆酸盐载体的纳米药物提供了良好的生物学基础。基于胆酸盐递送系统制备的纳米制剂不仅能够提高药物的水溶性，还可借助胆酸盐转运机制促进目标药物在肠道中的快速吸收，从而显著提升生物利用度。前期研究表明^[16]，胆酸盐纳米载体可有效将氯硝柳胺快速递送至全身，并在动物模型中展现出良好的抗COVID-19效果。提示胆酸盐递送系统作为一种新型纳米平台，在保障药物安全性的同时，能够显著提高脂溶性药物的水溶性和生物利用度，具有良好的应用前景。本研究以胆酸盐为载体，构建了包被FBZ的纳米药物，其颗粒约为300 nm，水溶性提高了约500倍，略低于氯硝柳胺水溶性的提高程度（约800倍），展现出良好的临床转化应用潜力。